eLife｜程博团队揭示转录因子GDOWN1通过核质转位调控全局转录及细胞应激的分子机制

撰文︱朱占武责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇

转录是中心法则的第一步，是调控真核生物基因表达的关键步骤。RNA聚合酶II（Pol II）催化真核生物基因组中绝大多数蛋白质编码基因和大量非编码基因的转录[1]。Pol II 与一系列转录因子相互作用，形成复杂的转录调控网络，使大部分基因在机体生长发育的特定时空下以合适的强度进行转录，从而维持细胞及生命体的正常生理生化活动[2]。Pol II的表达或功能异常会直接导致转录组失稳甚至细胞死亡[3]。因此，研究以Pol II 为中心的转录精细调控机制始终是细胞及分子生物学领域的核心科学问题之一。GDOWN1最早是在2006年报道的在动物组织中分离Pol II时一并被捕获的一个43 kDa的蛋白分子，因其与Pol II强烈互作被定义为Pol II第十三个亚基[4]。由于不是所有的Pol II都包含GDOWN1，因此它是目前已知的唯一的一个Pol II亚当量组分。体外生化实验证明，GDOWN1抑制一系列转录因子（如TFIIF，PAF1及TTF2）与Pol II 的结合及功能发挥，在Pol II转录的起始和延伸阶段都可能发挥重要调控作用[5-8]。细胞及动物实验证明，GDOWN1与真核细胞有丝分裂[7]，小鼠肝脏细胞静息态维持相关[9]。更为重要的是，GDOWN1是早期胚胎发育必需因子，GDOWN1在小鼠及果蝇胚胎中的敲除导致胚胎死亡[6,9]，且GDOWN1的亚细胞定位会随着胚胎发育发生改变[6]。尽管我们已经知道GDOWN1是一个核质穿梭蛋白且具有转录调控功能，但是GDOWN1进行核质穿梭的分子基础尚无报道，在体细胞中GDOWN1是否入核且如何调控转录的分子机制和生理功能也不甚明朗。

2022年12月7日，兰州大学生命科学学院程博教授团队在国际著名期刊eLife上发表了题为“Overcoming the cytoplasmic retention of GDOWN1 modulates global transcription and facilitates stress adaptation”的研究性文章。该文章鉴定了GDOWN1蛋白包含多重核输出以及细胞质锚定信号序列，这些定位调控信号将GDOWN1严格限制在细胞质内从而抑制其发挥转录调控功能。进一步研究发现打破这些抑制效应的GDOWN1在入核之后强烈下调Pol II并抑制细胞全局转录。同时，该文章揭示了内源GDOWN1在细胞应对砷化物诱导的氧化应激过程中进入细胞核，并且在细胞适应胁迫中发挥积极的作用。

为了深入探究GDOWN1在人类和哺乳动物体细胞中的功能，研究者利用慢病毒系统将带有不同标签的GDOWN1蛋白稳定地表达在HeLa细胞系中。令人惊奇的是，GDOWN1作为Pol II的强互作蛋白却严格地表达在细胞质中，且不会因为人为融合一个或多个核定位信号（Nuclear  Localization Signal, NLS）而转为核定位（图1A），说明GDOWN1是受严格调控定位于细胞质而单纯是缺少入核动力。进一步的，用不同种属，不同来源的体细胞进行核质分离实验验证了内源的GDOWN1均严格定位于细胞质中（图1B）。同时，研究者利用双分子荧光互补实验（BiFC）发现GDOWN1能够与一些核内转录调控蛋白（如NELF-E, SPT4, RPRD1A等）相互作用，但是互作信号意外出现在细胞质中（图1C）。以上实验揭示了GDOWN1在哺乳动物成体细胞中是一个严格定位于细胞质的蛋白。

图1 GDOWN1严格定位于细胞质

（图源：Zhu ZW, et al., eLife, 2022）

图2 NES和CAS的鉴定

（图源：Zhu ZW, et al., eLife, 2022）

为了进一步探究GDOWN1在细胞质滞留的分子机制，研究者用经典蛋白核输出通路的关键蛋白CRM1的抑制剂莱普霉素B（LMB）处理细胞，发现GDOWN1的核质定位并不会在LMB处理阻断蛋白出核的情形下而呈现在细胞核内的累积（图2A）。然而，BiFC和免疫共沉淀（co-IP）实验显示，GDOWN1与CRM1及其伴侣分子RAN存在相互作用（图2B）。以上结果提示，GDOWN1蛋白中很可能包含依赖于CRM1的经典核输出信号（Nuclear Export Signal, NES），但是也一定受到其他的不依赖于CRM1的细胞质定位调控。所以，研究者利用分子克隆技术构建了一系列表达GDOWN1截短突变体的质粒，瞬转进入细胞并用LMB处理，通过对GDOWN1亚细胞定位的数据分析及点突变验证，鉴定出GDOWN1的191-201 aa和332-340 aa是两个经典的NES，分别命名为NES1和NES2（图2A）。同时，研究者发现GDOWN1的352-357 aa是一个之前从未报道过的不依赖于CRM1的细胞质滞留信号，研究者将其命名为细胞质锚定信号（Cytoplasmic Anchoring Signal, CAS）（图2C）。对CAS的进一步研究发现，其可能是通过锚定在核孔复合体（NPC）的胞质侧使GDOWN1聚集在核周边而不能入核。位于352, 354和357位的精氨酸是CAS发挥功能的核心氨基酸，它们的点突变导致GDOWN1转变为响应LMB入核的蛋白（图2C, D）。

由于GDOWN1含有三个不同的核输出信号或细胞质锚定信号，确定这三个信号的独立性和相互关系尤为重要。所以研究者通过构建针对三个信号的单突变体，双突变体及三突变体，确定了NES1和NES2是两个相对独立的经典核输出信号，但CAS的功能一定程度上依赖于NES2（图3A, B）。这是由于NES2能够帮助CAS锚定在NPC上，NES2的突变体和CAS的突变体均失去核膜定位（图2D, 图3C）。研究者用果蝇和斑马鱼的GDOWN1蛋白进行了类似的实验和分析，发现CAS在果蝇和斑马鱼中功能保守（图3D）。

图3 NESs和CAS的相互关系及CAS的保守性

（图源：Zhu ZW, et al., eLife, 2022）

在上述研究的基础上，研究者构建了融合NLS和Venus荧光蛋白的GDOWN1蛋白的NESs和CAS三个定位调控模序全部突变的十点突变体[NLS-GDOWN1(10M)-Venus]，此突变体完全表达在细胞核内（图4A），利用慢病毒系统将上述突变体以可诱导的形式稳定表达在HeLa细胞系中，希望用此细胞系研究GDOWN1的核内功能。有趣的是，研究者发现表达NLS-GDOWN1(10M)-Venus的细胞相较于表达NLS-GDOWN1的细胞生长明显减缓且逐渐死亡（图4A）。为了探究细胞死亡的原因，作者利用EU-Apollo系统标记新生转录本检测细胞全局转录水平的变化，发现表达核定位的NLS-GDOWN1(10M)-Venus的细胞相较于对照细胞的全局转录水平显著降低，而表达胞质定位NLS-GDOWN1-Venus的细胞转录水平较对照细胞没有明显变化（图4B），充分证明了核内GDOWN1的累积导致细胞全局转录受到抑制。为了探究GDOWN1抑制全局转录的分子机制，研究者利用免疫印迹（WB）检测了NLS-GDOWN1(10M)-Venus表达后细胞内的Pol II的整体水平，发现GDOWN1在细胞核内的累积导致Pol II的蛋白水平出现大幅下降（图4C）。进一步地，作者利用免疫荧光（IF）检测了代表游离Pol II的非磷酸化态的Pol II水平，以及分别代表转录起始和转录延伸的CTD-S5P和CTD-S2P的磷酸化Pol II水平，发现随着GDOWN1在核内的积累，非磷酸化、CTDS2P和CTDS5P的Pol II水平均显著下降（图4D）。研究者由此得出结论，核内GDOWN1通过降低Pol II水平强烈抑制全局转录。

图4 核内GDOWN1通过降低Pol II的水平抑制全局转录并导致细胞死亡

（图源：Zhu ZW, et al., eLife, 2022）

GDOWN1在什么情况下会入核发挥转录抑制功能呢？研究者发现，内源GDOWN1会响应亚砷酸钠的刺激入核，且在除去亚砷酸钠刺激后可再次回到细胞质，证明GDOWN1响应亚砷酸钠入核是主动且可逆的过程（图5A）。因为砷化物刺激会引发细胞产生应激颗粒（Stress Granule, SG），为了进一步研究GDOWN1与应激之间的关系，研究者在HeLa细胞中敲除或过表达GDOWN1，并用亚砷酸钠处理，发现敲除GDOWN1后SGs显著增多，而过表达GDOWN1后SGs显著减少（图5B），证明GDOWN1对应激颗粒的形成有重要功能。通过EU-Apollo实验检测发现，亚砷酸钠处理后细胞的整体转录水平下降（图5C），这可能是细胞应对刺激的一种保护机制，GDOWN1可能参与了应激状态下的全局转录抑制以帮助细胞渡过难关。与此一致的是，敲除GDOWN1使细胞对亚砷酸钠的刺激更加敏感（图5D）。综上，GDOWN1通过核质穿梭调控细胞对亚砷酸钠的应激反应，帮助细胞应对外来刺激。

图5 GDOWN1参与细胞应对亚砷酸钠刺激的过程

（图源：Zhu ZW, et al., eLife, 2022）

图6 GDOWN1通过核质穿梭调节全局转录并促进细胞适应胁迫

（图源：Zhu ZW, et al., eLife, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究揭示了转录调控因子GDOWN1是一个调控全局转录的重要分子且其在体细胞中入核发挥功能受到严密的调控。该研究鉴定出GDOWN1包含新型细胞质锚定信号CAS并锁定了其发挥功能的关键氨基酸，CAS不依赖于CRM1而是通过与核孔复合体胞质侧的组分相互作用将GDOWN1锚定在核膜胞质侧阻抑其入核（图6）。该研究为蛋白核质穿梭领域的研究揭示了新途径。同时，该研究首次证明在生理条件下核内GDOWN1通过降低Pol II的水平抑制全局转录，明确了GDOWN1的核转位是细胞应激中自我保护性反应的一种方式（图6），为转录调控领域提供了可信的证据和新思路。值得注意的是，本研究中所用的材料大部分是外源表达的GDOWN1，内源GDOWN1除了在砷化物处理之外在其他什么条件下发生转位，发挥什么功能以其与外源表达GDOWN1的功能异同尚需进一步探索。另外，GDOWN1抑制全局转录的更深层次分子机制以及该抑制作用是否有时间及空间特异性仍有待深入解析。

原文链接：https://elifesciences.org/articles/79116

兰州大学生命科学学院朱占武博士研究生为论文的第一作者，程博教授为本论文通讯作者。该研究获得国家自然科学基金面上项目（31771447，31970624）的支持。

通讯作者：程博教授（左），第一作者：朱占武（右）

（照片提供自：程博教授实验室）

通讯作者简介（上下滑动阅读）

程博，教授，博士生导师，兰州大学生命科学学院副院长。2000年、2003年于南开大学生命科学学院获得生物化学及分子生物学学士、硕士学位。2003年赴美国爱荷华大学继续深造，师从转录领域著名科学家David Price教授，并于2008年获分子及细胞生物学博士学位。2009-2013年在美国密西根大学医学院生物化学系从事博士后研究，利用活细胞成像等技术研究小鼠胚胎干细胞中多梳抑制复合体PRC1的功能。2013年底加入兰州大学生命科学学院建立实验室，以动物细胞为模型，从事转录调控及表观遗传调控在细胞逆境适应与疾病发生中的分子机理研究。在Molecular Cell，Nucleic Acids Research，eLife，J Biol Chem，Mobile DNA等国际一流期刊发表一系列研究成果，先后主持多项国家自然科学基金项目和教育部细胞活动与逆境适应重点实验室开放基金，以及生物与医学、生物与力学两项“学科交叉创新项目”。目前为中国遗传学会染色质与表观遗传学分会委员，甘肃省细胞生物学学会秘书长。

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参考文献（上下滑动阅读）

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本文完